к. т. н. Егорова О.В.,
эксперт Госстандарта РФ по оптическим приборам

Микроскоп является одним из основных приборов при проведении цитологических исследований. Качество его работы, как сложной оптической системы, определяется технологическими особенностями прибора и его элементов. Качество же изображения в первую очередь определяется природой построения изображения препарата световым потоком, прошедшим через него. По теории образования изображения в микроскопе, созданной на предприятии Карла Цейсса математиком и физиком Эрнстом Аббе (1840-1905) [показать] в 1872 году, изображение является совокупностью дифракционного и интерференционного свойства света.

2005 год объявлен годом Аббе за вклад в развитие оптического приборостроения и за организацию Фонда "Carl ZEISS", объединившего приборостроительный завод "Zeiss" и завод по производству стекла "Schott".

Оба эти свойства влияют на качество изображения и на точность воспроизведения объекта в изображении, а Август Келер (1866-1948) в 1883 году опубликовал предписания по правильному освещению микроскопических препаратов.

С другой стороны, качество изображения оптической системы зависит и от ее технологического совершенства (наличия остаточных аберраций - искажений, дефектов стекла), сборки и центрировки.

Важной количественной характеристикой качества изображения служит разрешающая способность. Остаточные искажения вызывают перераспределение световой энергии в дифракционной картине, а внутренние дефекты объектива (и всей оптической системы микроскопа) приводят к образованию вредного рассеянного света и геометрического искажения дифракционной картины, накладывающихся на оптическое изображение, что снижает разрешающую способность и контраст изображения.

Разрешающей способностью оптической системы называется ее свойство изображать раздельно две точки или две линии, расположенные в пространстве предметов. Мерой разрешающей способности служит наименьшее линейное или угловое расстояние между двумя точками (линиями), изображения которых раздельно строятся оптической системой.

Оптическую систему принято считать совершенной, если разрешающая способность ограничена только дифракцией света на краях оправы объектива или апертурной диафрагмы конденсора. Дифракция света, обусловленная волновой природой света, нарушает прямолинейное распространение света; светящаяся точка изображается в виде круглого пятна, называемого кружком Эри, окруженного темными и светлыми кольцами убывающей яркости. Около 84% световой энергии сконцентрировано в центральном пятне, 7% - внутри первого светлого пятна и 9% - в остальных кольцах. Радиус р (рис. 1) первого темного кольца в плоскости изображения определяется выражением р = 1,22λ f , / D (1), где λ - длина волны света; f , - фокусное расстояние оптической системы; D - диаметр действующего отверстия системы (апертуры).

Величина р равна расстоянию между центрами изображения двух точек А и В; р можно определить по формуле р = 0,61λ / sin σ , , (2), где σ , - апертурный угол в пространстве изображений.

При λ = 0,560 мкм = 560 нм р = 0,34 / σ , где р измеряется в микрометрах.

Изображения двух светящихся точек, построенные оптической системой, представляют собой два пятна с нерезкими краями. По мере сближения точек пятна соприкасаются, потом перекрываются и затем сливаются (рис. 1).

Глаз может видеть две точки в плоскости изображения раздельно при некотором минимальном расстоянии р между ними и необходимой разности освещенностей в точке минимума а и максимумов А или В. Контрастная чувствительность для среднего глаза равна 5%. Отношение освещенности в точке а к освещенности в точке А или В достигает 85%.

Разрешающую способность оптических систем определяют с помощью штриховых или радиальных мир, выполненных на стеклянных пластинках (рис. 2). На темном фоне фотолитографическим способом нанесены светлые штрихи или сектора. Выпускают стандартные штриховые миры шести номеров (для оценки разрешающей способности объективов фотоаппаратов и других оптических приборов и узлов) и миру № 0 для автоколлимационной оценки разрешающей способности объективов микроскопа. Каждая мира состоит из 25 элементов, оцифрованных по краям и имеющих по четыре группы штрихов с шириной штриха, меняющейся от одного элемента к другому. Под шириной штриха понимают осевое расстояние между двумя соседними темными или светлыми полосами, т. е. суммарная ширина темной и светлой полос равна ширине одного штриха. Все стандартные миры имеют абсолютный контраст К = 1.

Разрешающую способность объектива микроскопа определяют в линейной мере. Для несамосветящихся объектов предел разрешения d = λ / A (3), где А - числовая апертура, равная произведению показателя преломления п среды между объективом и предметом и sin σ .

При наблюдении периодической структуры наименьшее расстояние d , согласно теории Аббе, зависит от апертуры объектива и апертуры конденсора: d = λ / (A + A k) , (4), где A k - числовая апертура конденсора.

Если апертура конденсора равна апертуре объектива, то разрешающая способность микроскопа для самосветящихся объектов определяется формулой d = λ / (2A) (5)

Следует отметить, что чем более тонкие исследования проводятся, тем более сопоставимым должно быть расчетное качество объектива и конденсора (осветительной системы). Например, новые исследовательские и универсальные микроскопы "Axio Imager" имеют принципиальный расчет IC2S оптики, уравнивающий качество объектива и осветительной системы.

Из приведенных формул следует, что чем короче длина волны света и больше апертура объектива, тем выше разрешающая способность объектива микроскопа.

Для увеличения разрешающей способности микроскопа можно использовать иммерсионные жидкости, которые заполняют пространство между рассматриваемым предметом и объективом микроскопа. Благодаря этому числовая апертура объектива микроскопа может быть доведена до 1,45, а предельное разрешаемое расстояние при λ = 0,56 мкм - до d = 0,17 мкм.

На повышение разрешающей способности влияет соотношение светового потока, прошедшего через препарат (апертура конденсора) и воспринятого объективом (апертура объектива). Если препарат контрастный (после проведенной обработки и окраски соответствующим способом), то по принципу Келера при настройке освещения допустимо раскрытие апертурной диафрагмы конденсора до величины числовой апертуры объектива или с помощью ирисовой диафрагмы размер апертурной диафрагмы конденсора может быть уменьшен на 1/3.

Таким образом, величина разрешающей способности может быть рассчитана как по формуле (5), так и по формуле (2) соответственно. Поэтому при работе с объективом А = 1,25 можно применять конденсор как с числовой апертурой А = 0,9 (сухой, разрешающая способность рассчитывается по формуле 2), так и А = 1,25 (иммерсионный, разрешающая способность рассчитывается по формуле 5), при этом не забываем, что для получения А = 1,25 на конденсор необходимо "капать" иммерсионное масло.

В табл. 1 представлены расчетные значения разрешающей способности объективов, традиционно применяемых для медико-биологических исследований.

На рис. 3 представлены примеры изображений при правильно настроенном микроскопе (а) и при неправильной настройке осветительной системы микроскопа (б, в). Как видно, неправильная настройка влияет на разрешающую способность микроскопа, а также на точность передачи элементов препарата в его изображении.

Как уже было сказано, разрешение может быть повышено за счет применения цветных светофильтров. Традиционными являются синий, зеленый, желтый и красный. Однако если синий и зеленый действительно влияют на повышение разрешающей способности, то желтый и красный работают на повышение контраста, т. е. усиливают разницу между средой и препаратом.

Таким образом, на разрешающую способность в микроскопе влияют:

• параметры объектива (числовая апертура объектива);
• возможность настройки освещения по Келеру (регулируемые полевая и апертурная диафрагмы, фокусировочное перемещение конденсора и возможность его центрировки, возможность центрировки нити лампы, если лампа не является самоцентрируемой);
• качество оптики микроскопа (расчетное и технологическое);
• применение светофильтров в коротковолновой области спектра (от УФ до зеленой).

Источник : И.П. Шабалова, Т.В.Джангирова, Н.Н.Волченко, К.К.Пугачев. Цитологический атлас: Диагностика заболеваний молочной железы.- М.-Тверь: ООО "Издательство "Триада", 2005

Технически возможно создать оптические микроскопы, объективы и окуляры которых дадут общее увеличение 1500-2000 и больше. Однако это нецелесообразно, так как возможность различить мелкие детали предмета ограничивается дифракционными явлениями. Вследствие этого изображение мельчайших деталей предмета теряет резкость, может возникнуть нарушение геометрического подобия изображения и предмета, соседние точки будут сливаться в одну, возможно полное исчезновение изображения. Поэтому в оптике существуют следующие понятия, которые характеризуют качество микроскопа:

Разрешающая способность микроскопа - свойство микроскопа давать раздельно изображение мелких деталей рассматриваемого предмета.

Предел разрешения - это наименьшее расстояние между двумя точками, которые видны в микроскопе раздельно.

Чем меньше предел разрешения, тем выше разрешающая способность микроскопа!

Предел разрешения обусловливает наименьший размер деталей, которые могут различаться в препарате с помощью микроскопа.

Теорию разрешающей способности микроскопа разработал директор завода К.Цейса в Йене профессор-оптик Э.Аббе (1840-1905). В качестве простейшего микропрепарата он взял дифракционную решетку (рис. 2), изучил механизм формирования изображения в микроскопе и показал следующее.

Введем понятиеапертурного угла - это угол между крайними лучами конического светового пучка, идущего от середины объекта в объектив (рис. 3,а ). Для создания изображения, то есть для разрешения объекта, достаточно, чтобы в объектив попали лучи, образующие максимумы только нулевого и первого порядка хотя бы с одной стороны (рис. 2 и 3,б ). Участие в образовании изображения лучей от большего количества максимумов повышает качество изображения, его контраст. Поэтому лучи, образующие эти максимумы, должны быть в пределах апертурного угла объектива.

а) б) в) г)

1- фронтальная линза объектива, 2 - объектив

Таким образом, если объектом является дифракционная решетка с периодом d и свет падает на нее нормально (рис.2 и 3,б ), то в формировании изображения обязательно должны участвовать лучи, образующие максимумы нулевого и первого порядков с обеих сторон, а угол j 1 - угол отклонения лучей, образующих максимум первого порядка, соответственно должен быть, в крайнем случае, равен углу U /2.

Если же взять решетку с меньшим периодом d ’, то угол j’ 1 будет больше угла U /2 и изображение не возникнет. Значит период решетки d можно принять за предел разрешения микроскопа Z . Тогда, используя формулу дифракционной решетки, запишем для k =1:

Заменяя d на Z , а j 1 на U /2, получим

. (6)

Во время микроскопии световые лучи падают на объект под разными углами. При наклонном падении лучей (рис.3,г ) предел разрешения уменьшается, так как в формировании изображения будут участвовать только лучи, образующие максимумы нулевого порядка и первого порядка с одной стороны, а угол j 1 будет равен апертурному углу U . Расчеты показывают, что формула для предела разрешения в этом случае принимает следующий вид:

. (7)

Если пространство между объектом и объективом заполнить иммерсионной средой с показателем преломления n , который больше показателя преломления воздуха, то длина волны света l n = l ¤ n . Подставляя это выражение в формулу для предела разрешения (7), получим

, или . (8)

Таким образом, формула (7) определяет предел разрешения для микроскопа с сухим объективом, а формула (8) -для микроскопа с иммерсионным объективом. Величины sin 0,5U и n× sin0,5U в этих формулах называют числовой апертурой объектива и обозначают буквой А . Учитывая это, формулу предела разрешения микроскопа в общем виде записывают так:

Как видно из формул (8) и (9), разрешающая способность микроскопа зависит от длины волны света, величины апертурного угла, показателя преломления среды между объективом и объектом, угла падения световых лучей на объект, но она не зависит от параметров окуляра. Окуляр никакой дополнительной информации о структуре объекта не дает, качества изображения не повышает, он лишь увеличивает промежуточное изображение.

Разрешающая способность микроскопа может быть повышена за счет использования иммерсии и уменьшения длины волны света. Повышение разрешающей способности при использовании иммерсии можно пояснить следующим образом. Если между объективом и объектом находится воздух (сухой объектив), то световой луч при переходе из покровного стекла в воздух, среду с меньшим показателем преломления, значительно изменяет свое направление в результате преломления, поэтому меньше лучей попадает в объектив. При использовании иммерсионной среды, показатель преломления которой приблизительно равен показателю преломления стекла, изменение хода лучей в среде не наблюдается и большее количество лучей попадает в объектив.

В качестве иммерсионной жидкости берут воду (n =1,33), кедровое масло (n =1,515) и др. Если максимальный апертурный угол у современных объективов достигает 140 0 , то для сухого объектива А =0,94, а для объектива с масляной иммерсией А =1,43. Если при расчете использовать длину волны света l = 555 нм, к которой наиболее чувствителен глаз, то предел разрешения сухого объектива составит 0,30 мкм, а с масляной иммерсией - 0,19 мкм. Значение числовой апертуры указывается на оправе объектива: 0,20; 0,40; 0,65 и др.

Повышение разрешающей способности оптического микроскопа за счет уменьшения длины волны света достигается при использовании ультрафиолетового излучения. Для этого имеются специальные ультрафиолетовые микроскопы с кварцевой оптикой и приспособлениями для наблюдения и фотографирования объектов. Так как в этих микроскопах используется свет с длиной волны примерно в два раза меньше, чем у видимого света, то они способны разрешать структуры препарата размерами около 0,1мкм. Ультрафиолетовая микроскопия имеет еще одно преимущество - с ее помощью можно исследовать неокрашенные препараты. Большинство биологических объектов прозрачны в видимом свете, так как не поглощают его. Однако они обладают избирательным поглощением в ультрафиолетовой области и, следовательно, легко различимы в ультрафиолетовых лучах.

Наибольшая разрешающая способность у электронного микроскопа, так как длина волны при движении электрона в 1000 раз меньше длины световой волны.

Полезное увеличение микроскопа ограничено его разрешающей способностью и разрешающей способностью глаза.

Разрешающая способность глаза характеризуется наименьшим углом зрения, при котором человеческий глаз еще различает раздельно две точки предмета. Она лимитируется дифракцией на зрачке и расстоянием между светочувствительными клетками сетчатки. Для нормального глаза наименьший угол зрения равен 1 минуте. Если предмет находится на расстоянии наилучшего зрения - 25 см, то этот угол соответствует предмету размером 70 мкм. Данную величину считают пределом разрешения невооруженного глаза Z r на расстоянии наилучшего зрения. Однако показано, что оптимальная величина Z r равна 140-280 мкм. При этом глаз испытывает наименьшее напряжение.

Полезным увеличением микроскопа называют его максимальное увеличение, при котором глаз еще в состоянии различать детали, равные по величине пределу разрешения микроскопа.

Линейное увеличение микроскопа равно отношению величины изображения предмета, расположенного на расстоянии наилучшего зрения, к величине самого предмета (см. формулу 1). Если за размер предмета примем предел разрешения микроскопа Z , а за размер изображения - предел разрешения невооруженного глаза на расстоянии наилучшего зрения Z r , то получим формулу полезного увеличения микроскопа:

Подставляя в эту формулу Z из выражения (9), получим

. (11)

Подставив в формулу (11) длину волны света 555 нм (555×10 -9 м), оптимальные величины пределов разрешения глаза 140-280 мкм (140-280×10 -6 м), найдем интервал значений полезного увеличения микроскопа

500 А < К п < 1000 А .

Например, при использовании лучших иммерсионных объективов с числовой апертурой 1,43 полезное увеличение будет составлять 700-1400, отсюда видно, что конструировать оптические микроскопы с большим увеличением нецелесообразно. Однако в настоящее время этот вопрос потерял свою остроту в связи с широким использованием в биологии и медицине электронного микроскопа, обеспечивающего увеличение до 600 000, а предел разрешения - до 0,1 нм.

Elena 2577

В этой статье пойдет речь об увеличении микроскопа, единицах измерения данной величины, способах визуального определения разрешающей мощности прибора. Также поговорим о стандартных параметрах этого значения и способах расчета увеличения для конкретного типа работ.

Чаще всего основные параметры мощности микроскопа указываются на корпусе объектива. Выкрутите объектив и осмотрите его. Вы можете видеть две цифры, записанные через дробь. Первая – увеличение, вторая – числовая апертура.

Апертура характеризует возможность прибора собирать свет и получать четкое изображение. Также на объективе могут быть указаны длина тубуса и толщина покровного стекла, необходимые для работы.

Все об увеличении микроскопа

Увеличение измеряется в кратах (х). Взаимоотношение системы окуляр-объектив полностью определяет его значение. Произведение увеличения окуляра и объектива говорит нам о рабочем увеличении, которое создает данный микроскоп. Зависимость общего увеличения от увеличения объектива очевидна. По мощности объективы делятся на следующие группы:

Малые (не больше 10х);

Средние (до 50х);

Большие (более 50х);

Сверхбольшие (более 100х).

Максимальное значение увеличения объектива для оптического микроскопа – 2000х. Значение окуляра обычно равно 10х, оно редко меняется. А вот увеличение объектива варьирует в широких пределах (от 4 до 100х и 2000х).

Выбирая микроскоп, необходимо учитывать, кто на нем будет работать, и какое максимальное увеличение может понадобиться. Например, дошкольнику достаточно 200х, школьные и университетские микроскопы имеют увеличение от 400-1000х. А вот исследовательский прибор должен давать не менее 1500-2000х. Это значение позволяет работать с бактериями и мелкими клеточными структурами.

		SunnyToy	10 490 Р
		SunnyToy	20 990 Р
		SunnyToy	34 990 Р
		ofko.ru	15 924 Р
		Kids4kids	2 715 Р
	Еще предложения

Разрешающая способность прибора

Отчего зависит четкость и качество картинки, которую дает микроскоп? На это влияет разрешающая способность прибора. Для вычисления этой величины нужно найти частное длины световой волны и двух числовых апертур. Следовательно, ее определяют конденсор и объектив микроскопа. Напоминаем, что значение числовой апертуры можно увидеть на корпусе объектива. Чем оно выше, тем лучше разрешение у прибора.

Оптический микроскоп имеет предел разрешения 0,2 микрона. Это минимальное расстояние до изображения, когда различимы все точки объекта.

Полезное увеличение микроскопа

Про полезное увеличение мы говорим, когда глаз исследователя полностью использует разрешающую способность микроскопа. Это достигается путем наблюдения за объектом под предельно допустимым углом. Зависит полезное увеличение только от числовой апертуры и типа объектива. При его вычислении числовая апертура увеличивается в 500-1000 раз.

Сухой объектив (между объектом и линзой только воздушная среда) создает полезное увеличение 1000х, т.е. числовая апертура равняется 1.

Иммерсионный объектив (между объектом и линзой слой иммерсионной среды) создает полезное увеличение 1250х, т.е. числовая апертура равняется 1,25.

Размытое или нечеткое изображение говорит о том, что полезное увеличение больше или меньше приведенных выше значений. Увеличение или уменьшение заданной величины значительно ухудшает работу микроскопа.

В этой статье мы говорили об основных характеристиках оптического микроскопа и методах их расчета. Надеемся, данная информация станет полезной при работе с этим сложным прибором.

Рассказать друзьям